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双特异性抗体，可同时结合两种不同的靶点，从而达到相应的治疗效果，相比于但特异性抗体，双抗具有特异性强，副作用小的优点，因此双特异性抗体成为各大药企竞争的焦点，值得注意的是仅2022年就有5款双特异性抗体获批上市(表1)，然而与单抗相比，双抗的表达过程会存在更多的副产物如半抗体、3/4抗体、同源二聚体、轻链缺失、单臂缺失以及聚集体等副产物，这些副产物的存在严重干扰双特异性抗体的有效性以及安全性。本文从下游纯化的角度综述了亲和层析、离子交换层析、混合模式层析以及疏水和分子筛用于去除副产物的策略。
双特异性抗体副产物示意及去除策略
亲和层析
Protein A亲和层析法可以说是双特异性抗体下游加工中常用的捕获纯化方法之一。这种纯化是通过Protein A与靶分子的Fc区以及重链可变结构域区相互作用从而实现抗体的捕获作用。样品通常在pH7.0-7.4的平衡步骤后进行上样，然后通常使用平衡缓冲液洗涤步骤(用于去除未结合杂质)，在低pH<4.0时使用醋酸盐、柠檬酸或甘氨酸缓冲液进行等度洗脱或梯度洗脱用于去除杂质。除了具有捕获作用外，Protein A还具有一定杂质去除能力。具体来看Protein A亲和层析具有一定的同源二聚错配去除能力，这部分去除能力是基于两条重链对于protein A存在亲和力差异。最典型是FcFc*型双特异性抗体，其中Fc*通过基因工程的手段消除了protein A结合能力，因此双抗分子对protein A结合能力介于Fc* Fc*以及FcFc之间，其中Fc* Fc*与protein A不结合随流穿液去除，而FcFc与protein A结合里较强，通常需要通过再生步骤进行去除。其次protein A 亲和层析基于亲和力差异，对半抗体以及3/4抗体以及单臂缺失副产物具有较好的去除能力，如图1所示，protein A 通过pH梯度洗实验，可以有效将主峰与半抗体(A)，单臂缺失抗体(B)以及3/4抗体(C)相分离。此外，如图2所示，在洗脱缓冲液中添加，300mM CaCl2或者500 mM NaCl可以显著提高主峰与半抗体的分辨率。此外，在protein A亲和层析过程中，在淋洗以及洗脱液添加一定量的CaCl2以及聚乙二醇，可以有效去除聚集体，如图3所示，在洗脱液中添加5%PEG以及500mM CaCl2,可以使得单体的含量在95%以上。
图1.ProteinA pH梯度实验去除半抗体，单臂缺失抗体以及3/4抗体
图2.不同盐浓度对protein A 亲和层析去除半抗的影响
图3.protein A 亲和层析去除聚体
离子交换色谱
基于电荷的纯化通常以离子交换色谱的形式作为精纯步骤，通常用来纯化电荷异构体以及具有电荷差异的错配体。因此选用离子交换色谱前考虑目标分子的等电点是很重要的，一般来说缓冲液的pH距离目标分子等电点1-3个单位。由于大多数双抗的等电点在6.0-8.0之间，因此优先推荐使用阴离子层析的流穿模式以及阳离子层析的结合洗脱模式。具体来看，阳离子层析结合洗脱模式配以pH线性梯度洗脱，对等电点差异较小的副产物具有较好的分辨率。如图4所示，Mono S 5/50GL 结合pH4.0 到 11.0的pH梯度对pI相差仅为0.4的副产物具有较好的分辨率。阴离子层析流穿模式通常可以去除等电点小于目标抗体的副产物，(在层析过程中，pI较小的副产物会结合在阴离子层析柱上)，此外，对于等电点差距较小的副产物，也会存在一种特殊的弱结合作用力，通过阴离子层析进行去除。
图4.阳离子层析pH梯度洗脱(三个峰等电点分别为8.95,8.36,8.73)
混合模式层析
混合模式层析通常是指同时具有两种及以上作用力的层析模式，常用于双特异性抗体纯化的有阳离子层析+疏水作用，以及阴离层析+疏水作用。目前有部分研究证明，混合模式层析可以用于替代protein A亲和层析进行双抗捕获。此外，相对于传统的离子交换，混合模式层析可以提供更宽泛的操作空间，以及较高的分辨率。如图5所示，Capto MMC一步层析过程可以有效将半抗体以及同源二聚体相互分离。与此同时，由于同时具备两种以上的作用力，混合模式的工艺开发也存在着一定的挑战。此外，混合模式层析对轻链缺失副产物也有较好的去除效果，如图6所示，Capto MMC配以0-1M NaCl线性梯度，可有效去除轻链缺失副产物。近年来pH-NaCl双梯度的策略，也常常可见于混合模式工艺开发。如图7，所示Capto MMC 配以0-250mM NaCl、pH6.0-8.5 双梯度可以有效分离半抗体、单臂缺失副产物以及轻链缺失副产物。
图5.MMC对半抗体、同源二聚体的去除能力
图6.MMC对轻链缺失副产物的去除能力
图7.MMC对半抗体A、单臂缺失副产物B以及轻链缺失副产物C的去除能力
疏水层析以及尺寸排阻色谱
疏水层析主要依据蛋白表面疏水性差异进行分离纯化，通常在上样阶段需要添加高浓度的盐，如硫酸铵来促进目标抗体与疏水层析介质相互作用，通常来说疏水层析主要用于聚集体的去除。但是由于疏水层析收率低，并且重复性较差因此很好应用于双特异性抗体的商业化生产中。
尺寸排阻色谱(SEC)通过分子量的差异来进行分离纯化，有研就表明，Zenix SEC-300可以有效去除聚集体，然而SEC通常需要较高的柱高，这就导致需要较高体积的层析缓冲液以及较长的工艺时间，因此SEC也很少应用于双特异性抗体商业化纯化生产阶段，而更多可用于质量分析模块。
总结
随着第九款双特异性抗体的上市，双抗赛道的竞争则更加激烈，相比于单抗来说，双特异性抗体副产物多，下游纯化难度大，因此制定合适的策略尤为重要，本文系统总结了双抗副产物的去除策略可为双抗下游纯化提供参考。
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