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色谱填料又称为“层析介质”，是色谱技术的核心关键，对分离纯化的结果和效率起着至关重要的作用，特别在生物制药领域，生产环节下游需通过分离纯化提高产品的纯度和收率，保障产品质量和稳定性。因此，生物制药生产效率的提高与生产成本的降低，离不开下游分离纯化工艺的突破创新，其中色谱填料/层析介质及其工艺的发展起着重要的作用。
发展历程
不同功能化的色谱填料和层析介质是液相色谱和层析广泛应用的基础。色谱或层析分离效果很大程度上取决于色谱填料和层析介质。从历史来看，分离材料的发展是推动层析技术进步的主要因素，高性能新型色谱填料及层析介质的不断出现是色谱和层析分离和分析技术发展的有效驱动力。
图1 分离材料的发展历程
关于色谱技术
色谱技术是一种重要的生物物理技术，能够分离、鉴定和纯化混合物的组分，以进行定性和定量分析。蛋白质可以根据大小和形状、总电荷、表面上存在的疏水基团以及与固定相的结合能力等特性进行纯化。基于分子特性和相互作用类型的四种分离技术利用亲和、离子交换、疏水和体积排阻等机理。
表1 不同分离技术分离特性及应用图片
色谱法基于将混合物中的分子施加到表面或固体中，流体固定相(稳定相)在流动相的帮助下移动时彼此分离的原理。对该分离过程有效的因素包括与吸附(液固)，分配(液固)相关的分子特征，以及它们分子量之间的亲和力或差异。由于这些差异混合物的某些组分在固定相中停留的时间更长，它们在色谱系统中移动缓慢，而其他组分则迅速进入流动相，并更快地离开系统。
关于色谱填料
色谱填料是具有纳米孔道结构的微球材料，粒径在微米尺度，而填料上的纳米孔道孔径大小在5-200 nm范围内。色谱填料的性能取决于其形貌、结构、粒径大小和分布、孔径大小和分布、材质组成及表面功能基团。从结构来看主要由基质和官能团两部分组成，其中基质是支撑填料的固体部分，使填料具有一定的形状，官能团固定或结合在其上形成色谱填料，决定了分离模式和分离选择性。
色谱填料的基质主要可分为无机介质与有机聚合物，其中有机聚合物又包括天然聚合物和合成聚合物。基质材料通常为亲水性固体材料，且易于化学修饰，可易于蛋白质进入的孔隙，用于蛋白自吸附的高表面积，以及优异的化学和物理稳定性。目前主流包括无机介质的硅胶(二氧化硅)以及有机介质的天然聚合物(琼脂糖等)和合成聚合物(聚苯乙烯等)见表2。
基体通常是球形的，也有无定形的。色谱分离对于填料的物理性质有多方面要求:具备合适的大小和较窄的粒度分布范围，具备一定的机械强度，有一定的孔径大小和良好的孔径分布，溶胀或收缩现象不能超出所允许的限制范围，亲水性质等。这些物理性质主要取决于基体。
表2 色谱填料基质材料分类
纯化策略
近年来，色谱技术进入了高速发展期，成为了蛋白质分离纯化领域中重要的一种手段。尤其是生物技术产品，包括了疫苗、生长激素、凝血因子等。随着后基因组计划的实施，各种在细菌、酵母、昆虫细胞以及对于哺乳动物细胞等表达系统中开发的基因重组药物，自然界低丰度蛋白质的发现等，都对色谱纯化技术提出了更高的要求。
下游加工工艺从细胞或培养基收获开始。各种表达系统中杂质的多样性对纯化策略至关重要。经过破碎澄清后的粗提物中包含载体、细胞宿主碎片、蛋白质、基因组DNA、血清蛋白、培养基的部分成分、辅助DNA或辅助病毒等成分。这些杂质可能毒害细胞，降低转导效率，甚至诱发全身免疫反应或炎症反应。目的产物的纯度、功效和安全标准受到监管机构严格的审查。在整个纯化过程中还需尽可能保持病毒活性完整，考虑到病毒颗粒复杂而脆弱的结构，研究人员们需根据不同的产品开发相对应的下游纯化策略。
在开始纯化蛋白质之前，我们应首先了解所纯化蛋白质的用途、纯度、所需的浓度以及储存条件。在设计和确定一个经济、省时且能进行大量目的蛋白纯化的方案时，所有因素都是至关重要的。FDA批准的适用于临床试验的产品纯化工艺依赖于商业规模的工艺。优化的纯化工艺克服了产品生产对人类治疗研究和药物制备的瓶颈。未来成熟高效的下游纯化策略需要更高效的色谱技术作为支撑。
色谱填料国产化进程
生物药生产主要耗材包括上游发酵和下游纯化两部分，上游工艺随微生物发酵工程相关技术进步和培养基等主要原材料的国产化，成本占比已降至30%或更低，而下游纯化，由于国产化替代推进较慢，成本占比高达70%左右。国内由于相关材料研发以及生产制造起步较晚，目前产业实现自产的企业较少，但经过多年的发展，国产填料技术与品质已大幅改善，部分产品的性能已达到甚至超越进口产品水平。
在产品质量达标的前提下，国产填料厂商在市场响应和价格方面具备较大优势。境外色谱填料厂商供货周期普遍较长，对比来看国内厂家的供货周期一般为2周左右，在时效性方面具备明显优势；国内企业在客户沟通和技术支持方面相比境外填料厂商速度也更快。此外考虑到国内药物领域的竞争以及医保谈判、国家集采等药政的影响，下游生产企业对成本的敏感性也将大幅提升，国产填料具备突围的充分条件。
结论
在高技术材料领域，研发生产经验积累后的产品升级迭代是巩固竞争力的必然之举。百林科医药科技(上海)有限公司经多年的努力已形成全面的产品矩阵，为精益求精、重点领域实现追赶和反超国际水平，公司每年持续较多投入研发费用开发新产品，其目的均为在现有水平上进一步进行优化改善，以达到或者超过国外产品水平。目前百林科已成功推出全品类层析填料产品，并已在国内多家客户处成功应用。
表3 百林科色谱填料产品概览
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参考文献
[1] Câmara J S, Martins C, Pereira J A M, et al. Chromatographic-Based Platforms as New Avenues for Scientific Progress and Sustainability[J]. Molecules, 2022, 27(16): 5267.
[2] 何云超.大孔二氧化硅的制备和应用以及纳米核壳型色谱填料的研究[D].华东理工大学.2018.
[3] Coskun O. Separation techniques: chromatography[J]. Northern clinics of Istanbul, 2016, 3(2): 156.
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