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内毒素是生物制品中最主要的热原污染
极微量内毒素进入人体
就会引起高热、腹泻、血管扩张
甚至昏厥或死亡
为更大程度地去除内毒素和避免内毒素污染，
应积极优化生物制品的制备工艺。
不同来源的内毒素差异性较大
即使同一样品不同的内毒素分子差异性也较大
内毒素的性质差异如此之大，给内毒素的去除带来了极大的挑战和难题。生物制品的内毒素去除，应结合不同生物制品的不同工艺和内毒素的特点，寻找有效去除内毒素的方法。
层析工艺是目前去除内毒素的有效手段之一
在层析工艺开发中，为了更好的去除生物制品中的内毒素，需要对有内毒素与蛋白质相互作用的生物制品，添加不同的添加剂来解离或降低这种相互作用。
内毒素的性质
内毒素是一种脂多糖，三个区域结构组成：脂质A区，核心多糖区和特异性多糖链区。单体分子为10kD~20kD，在不同成分的水溶液中，形成聚集体，最大可达1000kD。内毒素分子结构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白相互作用，形成复合物，大大增加去除的难度。
层析技术除去生物制品中的内毒素
层析纯化利用内毒素的不同性质，可以采用离子交换层析，疏水层析，凝胶层析，复合层析等层析填料，降低和去除生物制品中的内毒素。
1. 离子交换层析填料：
内毒素分子的等电点PI在2左右，内毒素在pH4~8的缓冲体系中带大量负电荷。通常与阴离子交换填料的正电荷配基相结合，并在高浓度盐时将其去除。而在pH4时，内毒素还是带负电荷，与阳离子交换填料不能结合，对于阳离子交换填料，可以的采用目标物结合而内毒素流穿的方式，去除内毒素。
因为非离子型去垢剂Triton X-100，Triton X-114和精氨酸，组氨酸等添加剂，有助于解离内毒素与样品分子的相互作用。所以，对于有些因内毒素与样品分子的相互作用，而在离子交换层析中内毒素去除效果不好或者内毒素浓度较高的生物制品中，可增加非离子型去垢剂和精氨酸，组氨酸等添加剂在淋洗步骤的缓冲液中，进行淋洗以降低生物制品洗脱液中的内毒素含量。
百林科MaXtar® Q HR层析填料，在某重组蛋白项目中，增加精氨酸淋洗工艺步骤，可以明显降低生物制品中的内毒素，如表1，所示。
表1：MaXtar® Q HR层析工艺去除内毒素效果
2. 疏水层析填料
内毒素的疏水特性，使得在高盐浓度(大于1.5M 硫酸铵)时容易容易聚集，且聚集体与疏水填料不结合，而部分未聚集的内毒素与填料结合紧密而不易洗脱，所以，上样时聚集部分直接流穿而去除内毒素，而未聚集部分保留较强(小于0.4~0.5M硫酸铵)，可通过盐梯度洗脱去除结合部分的内毒素。
对于内毒素与蛋白质有相互作用的生物制品分离，添加非离子型去垢剂，精氨酸，组氨酸添加剂，有利于降低内毒素与蛋白质的相互作用，由于内毒素与蛋白质疏水性的不同，根据高盐保留，低盐洗脱的疏水特性，通过疏水层析梯度洗脱的形式，去除内毒素。在上样样品添加1M精氨酸，降低内毒素与蛋白质的相互作用，达到去除内毒素的目的。百林科MaXtar® Butyl HR疏水填料，在某类病毒项目中去除内毒素效果，如表2，所示。
表2：MaXtar® Butyl HR层析去除内毒素内毒素效果
3. 凝胶层析填料
内毒素在一定成分的水溶液中可形成1000kDa分子量的聚集体，与蛋白分子的分子量相差较大，根据分子量大小使用凝胶层析分离，以去除内毒素。
4. 复合层析填料
复合层析填料MaXtar® MMA与MaXtar® MMC填料具有静电相互作用，氢键和疏水作用的等多功能性质。复合层析的离子和疏水的双重作用，在离子交换层析模式下，具有更宽的电荷结合和选择范围，蛋白质需在一定浓度的盐(0~0.5M NaCl)条件下上样，能够进行盐梯度和pH双梯度进行洗脱；而在疏水层析模式下较单一的疏水填料结合更牢固，对于去除内毒素，增加了更多的选择。
层析联用技术去除生物制品中的内毒素
对于内毒素的去除，单一的层析方法可以达到本步的优效果，但是并不能达到生物制品的内毒素的控制要求，通常需要多种层析工艺，进行联用以去除去内毒素的要求。
层析联用去除内毒素，应根据内毒素的性质，结合层析方法选择性，选择合适的层析方法进行联用。在某重组蛋白项目中，我们进行了工艺路线优化，以四种层析方法联用技术进行了纯度和内毒素的控制，每步层析在提高纯度的基础上，进一步进行内毒素的去除，整个工艺为一体，系统的去除内毒素，完成了各步的控制策略，结果见，表3。
表3：某重组蛋白项目纯化工艺数据
生物制品中的内毒素
内毒素是生物制品的关键质量属性，在层析纯化过程中，对相关物料清洁方法，以控制和除去内毒素：层析填料的清洁再生，一般使用0.5M NaOH+1~2 M NaCl进行CIP；
玻璃，塑料，硅胶管等管路或器皿上的内毒素，选择0.1~0.5M NaOH侵泡4h以上；玻璃和金属制品，一般使用180℃加热3~4h或者250℃加热1~2h。
表4：不同机理的常用填料去除内毒素特点
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